3768

 

 

اندازه گيري مقدار پروتئين شير به روش پيوند با آميدوبلاك

 

 

 

چاپ اول

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران تنها سازماني است در ايران كه بر طبق قانون ميتواند استاندارد رسمي فرآورده‏ها را تعيين و تدوين و اجراي آنها را با كسب موافقت شورايعالي استاندارد اجباري اعلام نمايد. وظايف و هدفهاي موسسه عبارتست از:

( تعيين، تدوين و نشر استانداردهاي ملي – انجام تحقيقات بمنظور تدوين استاندارد بالا بردن كيفيت كالاهاي داخلي، كمك به بهبود روشهاي توليد و افزايش كارائي صنايع در جهت خودكفائي كشور- ترويج استانداردهاي ملي – نظارت بر اجراي استانداردهاي اجباري – كنترل كيفي كالاهاي صادراتي مشمول استانداردهاي اجباري و جلوگيري از صدور كالاهاي نامرغوب به منظور فراهم نمودن امكانات رقابت با كالاهاي مشابه خارجي و حفظ بازارهاي بين المللي كنترل كيفي كالاهاي وارداتي مشمول استاندارد اجباري به منظور حمايت از مصرف كنندگان و توليدكنندگان داخلي و جلوگيري از ورود كالاهاي نامرغوب خارجي راهنمائي علمي و فني توليدكنندگان، توزيع كنندگان و مصرف كنندگان – مطالعه و تحقيق درباره روشهاي توليد، نگهداري، بسته بندي و ترابري كالاهاي مختلف – ترويج سيستم متريك و كاليبراسيون وسايل سنجش – آزمايش و تطبيق نمونه كالاها با استانداردهاي مربوط، اعلام مشخصات و اظهارنظر مقايسه‏اي و صدور گواهينامه‏هاي لازم ) .

موسسه استاندارد از اعضاء سازمان بين المللي استاندارد مي باشد و لذا در اجراي وظايف خود هم از آخرين پيشرفتهاي علمي و فني و صنعتي جهان استفاده مي نمايد و هم شرايط كلي و نيازمنديهاي خاص كشور را مورد توجه قرار مي دهد.

اجراي استانداردهاي ملي ايران به نفع تمام مردم و اقتصاد كشور است و باعث افزايش صادرات و فروش داخلي و تأمين ايمني و بهداشت مصرف كنندگان و صرفه جوئي در وقت و هزينه ها و در نتيجه موجب افزايش درآمد ملي و رفاه عمومي و كاهش قيمتها مي شود.

 

 

كميسيون استاندارد

اندازه گيري مقدار پروتئين شير به روش پيوند با آميدوبلاك

 

رئيس

مشاور موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

 دكتراي داروسازي

فرهي - فرج‏ا ...

 

اعضاء

دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي

 فوق ليسانس بيوشيمي

تمدن - حسين

واحد توليدي شير كامياب

 ليسانس صنايع غذائي

رحيمي - محمد

واحد توليدي شير كامياب

 ليسانس مهندسي كشاورزي

رضانيا - نرگس

كارخانجات صنايع شير

 ليسانس زيست‏شناسي

مرتضوي - محمدرضا

واحد توليدي شير دامداران

 دكتراي دامپزشكي

ميرحسيني - ميرحسين

 

دبير

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

 ليسانس تغذيه

اشرف جهاني – آزيتا

فهرست مطالب

 

هدف

دامنه كاربرد

تعريف

اساس آزمون

مواد مورد نياز

وسايل مورد نياز

نمونه‏برداري

روش آزمون

بيان نتايج

موارد خاص

گزارش آزمون

 

بسمه تعالي

پيشگفتار

 استاندارد اندازه‏گيري مقدار پروتئين شير به روش پيوند با آميدوبلاك كه بوسيله كميسيون فني مربوطه تهيه و تدوين شده و در يكصد و هفتاد و سومين كميته ملي استاندارد كشاورزي و غذائي مورخ 74/10/4 مورد تائيد قرار گرفته , اينك باستناد بند 1 ماده 3 قانون اصلاحي قوانين و مقررات مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مصوب بهمن ماه 1371 بعنوان استاندارد رسمي ايران منتشر ميگردد .

 براي حفظ همگامي و هماهنگي با پيشرفهاي ملي و جهاني در زمينه صنايع و علوم , استانداردهاي ايران در مواقع لزوم مورد تجديد نظر قرار خواهند گرفت و هرگونه پيشنهادي كه براي اصلاح يا تكميل اين استانداردها برسد در هنگام تجديد نظر در كميسيون فني مربوط مورد توجه واقع خواهد شد .

 بنابراين براي مراجعه به استانداردهاي ايران بايد همواره از آخرين چاپ و تجديد نظر آنها استفاده نمود .

 در تهيه و تدوين اين استاندارد سعي شده است كه ضمن توجه به شرايط موجود و نيازهاي جامعه حتي‏المقدور بين اين استاندارد و استاندارد كشورهاي صنعتي و پيشرفته هماهنگي ايجاد شود .

 لذا با بررسي امكانات و مهارتهاي موجود و اجراي آزمايشهاي لازم اين استاندارد با استفاده از منابع زير تهيه گرديده است :

1) ISO : 5542

Milk- Determination of protein content- Amido black dye- binding method 1984-06-01

 

2) Grant. Julius , HACKH'S Chemical dictionary , forth edition , Mc Graw Hill Book Company , USA , 1972

 

3) Bender , Duglas, Karmer , Statistical methods for food and agriculture , the AVI publishing company , USA , 1982

 

 اندازه‏گيري مقدار پروتئين شير به روش پيوند با رنگ آميدوبلاك 1

  1 ـ هدف

 هدف از تدوين اين استاندارد , اندازه‏گيري مقدار پروتئين شير به روش پيوند پروتئين با رنگ آميدوبلاك مي‏باشد .

  2 ـ دامنه كاربرد

 اين روش براي شير كامل 2, شير كم چرب , شير بدون چربي كه خام بوده و يا تحت فرآيند حرارتي يا مكانيكي قرار گرفته ( بطور مثال شير پاستوريزه , سترون 3, همگن 4 و بازساخته 5 كه وضعيت مطلوب دارند , قابل اجراء مي‏باشد . اين روش براي اندازه‏گيري مقدار پروتئين موجود در شير بصورت تك نمونه , تعداد محدودي نمونه , نمونه‏هاي متعدد و همچنين نمونه‏هاي حاوي نگهدارنده ( بند 10-1) كاربرد دارد .

 يادآوري : طبق منشأ نمونه و روش مرجع مورد استفاده , روش شرح داده شده در اين استاندارد , نه تنها براي اندازه‏گيري معمول مقدار پروتئين شير ( نيتروژن كل * 6/38) به كار مي‏رود , بلكه براي اندازه‏گيري مقدار پروتئين واقعي 6 و يا با اصلاحاتي براي اندازه‏گيري كازئين يا پروتئين آب پنير شير گاو و يا ساير دامها مورد استفاده قرار مي‏گيرد .

  3 ـ تعريف

 در اين استاندارد اصطلاحات با تعاريف زير به كار مي‏رود :

 مقدار پروتئين شير : طبق قرارداد مقدار پروتئين نمونه مورد آزمايش برابر حاصلضرب درصد وزني نيتروژن اندازه‏گيري شده با روش مرجع كجلدال ( طبق7 استاندارد ملي ايران به شماره 639) مي‏باشد .

 يادآوري : بايد توجه داشت كه مقدار پروتئين شير كه در بالا تعريف شد , عبارت است از مقدار پروتئين واقعي شير به اضافه مواد ازت‏دار غير پروتئيني 8 شير كه بر حسب پروتئين محاسبه شده است .

  4 ـ اساس آزمون

 افزودن محلول آميدوبلاك با 2/4 = PH به آزمونه 9 موجب تشكيل تركيب آميخته نامحلول پروتئين و رنگ مي‏گردد . اين تركيب آميخته نامحلول بوسيله سانتريفوژ ( يا صاف كردن ) از محلول جدا ميشود و جذب نوري مازاد رنگ باقيمانده در محلول اندازه‏گيري و مقدار پروتئين شير بر اساس منحني كاليبراسيون 10 محاسبه مي‏گردد .

  5 ـ مواد مورد نياز

 كليه مواد شيميائي بايد بصورت خالص شيميائي تهيه گردند :

 آب مصرفي , آب مقطر ( با هدايت ويژه كمتر از 5 ميكروزيمنس بر سانتيمتر ) يا آبي است كه داراي حداقل خلوص معادل با آب مقطر باشد .

 يادآوري : يونهاي كلسيم در اندازه‏گيري اختلال ايجاد مي‏كنند .

 5-1- رنگ ده ـ ب آميدوبلاك 11:

 اين ماده براي آزمايش شير بكار ميرود و مقدار رطوبت آن كمتر از 5 درصد ( جرم / جرم ) مي‏باشد .

 يادآوري : اين ماده رنگي جاذب‏الرطوبه مي‏باشد و بايد آن را در برابر جذب رطوبت محافظت كرد و نيز از آنجا كه تركيب رنگي آميدوبلاك قابل تغيير است , لذا شرح روش آزمون مبتني بر آزمايش تجربي و بر اساس نتايج ثابت مقدار پروتئين مي‏باشد . اين نتايج طبق روش مرجع كجلدال براي اندازه‏گيري مقدار نيتروژن شير بدست مي‏آيند .

 5-2- محلول استاندارد آميدوبلاك :

 يك محلول استاندارد مطابق يكي از روشهاي زير تهيه كنيد .

 5-2-1- محلول استاندارد اوليه :

 اين محلول براي تهيه محلولهاي مرجع استاندارد بكار مي‏رود و بصورت زير تهيه مي‏شود . در يك بشر يك ليتري كه محتوي 600 ميلي ليتر آب مقطر است , مقادير مواد زير را بيافزائيد .

 - 0/9 گرم رنگ ده ـ ب آميدوبلاك خالص حاوي مقدار زيادي ماده رنگي

 ـ 2/08 گرم دي سديم هيدروژن ارتوفسفات با دو مولكول آب تبلور

 ـ 15/8 گرم اسيد سيتريك با يك مولكول آب تبلور

 يادآوري : مواد شيميائي فوق را مي‏توان بصورت بدون آب يا آب تبلور مختلف مورد استفاده قرار داد و در هر مورد وزن ماده بايد تصحيح شود .

 پس از افزدن اين مقادير توسط به هم‏زن مكانيكي 12 به مدت 2 ساعت آنها را به هم بزنيد تا كاملا حل شوند . در خاتمه pH محلول را توسط PH متر ( بند 6-8) اندازه‏گيري كنيد . pH محلول بايد 2/4±0/1 در دماي آزمايشگاه (20 تا 25 درجه سلسيوس ) باشد و در صورت نياز pH را توسط محلول اسيد سولفوريك و يا هيدروكسيد سديم تنظيم كنيد .

 محتويات بشر را با آب مقطر بطور كمي به بالن حجمي 13 يك ليتري منتقل و به حجم برسانيد . سپس مدت 15 دقيقه آن را تكان دهيد .

 محلول را قبل از استفاده به مدت يك شب ساكن بگذاريد . در صورتي كه محلول بايد براي مدت چند روز مورد استفاده قرار گيرد , آن را با افزودن 0/1 ميلي ليتر محلول 5 درصد تيمول در الكل 94 تا 97 درصد ( حجم / حجم ) نگهداري كنيد .

 از اين محلول استاندارد اوليه , محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد 14 مطابق بندهاي 5-3-2 و 5-3-3 تهيه كنيد . جذب نوري اين محلول‏ها را نسبت به آب مقطر در طول موج استاندارد با يك سل 15 استاندارد بدست آوريد .

 5-2-2- محلول استاندارد :

 اين محلول براي اندازه‏گيري‏هاي روزمره با تعداد محدود بكار ميرود و بصورت زير تهيه مي‏شود .

 مقادير مواد زير را در يك بشر يك ليتري بريزيد .

 - 0/9 تا 0/95 گرم ( بر حسب مقدار ماده رنگي ) رنگ ده - ب آميدوبلاك

 - 2/08 گرم دي سديم هيدروژن ارتوفسفات با دو مولكول آب تبلور

 ـ 15/8 گرم اسيد سيتريك با يك مولكول آب تبلور

 يادآوري : به يادآوري بند 5-2-1 مراجعه شود .

 مقادير فوق را با 100 تا 200 ميلي ليتر آب مقطر در حرارت 70 تا 80 درجه سلسيوس حل كنيد . محلول بدست آمده را سرد و تا 600 ميلي ليتر با آب مقطر رقيق و مخلوط كنيد .

 pH اين محلول را مطابق بند 5-2-1 در 20 درجه سلسيوس در 2/4±0/1 تنظيم كنيد . محتويات بشر را بطور كمي به بالن حجمي يك ليتري منتقل و آن را به حجم برسانيد . سپس آن را به مدت 15 دقيقه تكان داده و به مدت يك شب ساكن بگذاريد .

 از اين محلول اوليه , محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد كه در بندهاي 5-3-2 و 5-3-3 مشخص گرديده است , تهيه و جذب نوري اين محلولها را نسبت به آب مقطر مطابق بند 5-2-1 تعيين كنيد .

 اين محلول اوليه را با مقدار حساب شده‏اي از محلول بافرسيترات (5-2-4) رقيق كنيد تا محلول استانداردي بدست آيد كه محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد آن داراي جذب نوري يكسان با محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد بدست آمده از محلول استاندارد اوليه ( بند 5-2-1) باشد . مطابق بند 5-2-1 به اين محلول نگهدارنده بيافزائيد و به مدت يك شب ساكن بگذاريد .

 يادآوري : از آنجا كه امكان تغيير غلظت آميدوبلاك از يك ساخت به ساخت ديگر وجود دارد , لذا ضروري است كه براي هر ساخت جديد غلظت استاندارد اوليه تهيه شده طبق بند 5-2-1 تنظيم گردد تا بدينوسيله جذب نوري محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد كه در بندهاي 5-3-2 و 5-3-3 تهيه گرديده‏اند , مطابق جذب نوري بدست آمده در هنگام تهيه منحني كاليبراسيون ( بند 8-5) شود .

 5-2-3- محلول استاندارد :

 اين محلول براي اندازه‏گيري‏هاي روزمره دسته‏هاي نمونه كاربرد دارد .

 در يك بشر كه داراي خط نشانه‏هايي با مضربي از 1000 مي‏باشد , مقاديري از مواد شيميائي و يا مضربي از آنها را كه در بند 5-2-2 مشخص گرديده است , بريزيد و مقداري آب مقطر تا زير خط نشانه به آن بيافزائيد و با به همزن مكانيكي به مدت 2 ساعت بطور كامل به هم بزنيد تا محتويات آن كاملا حل شود . سپس pH را در 20 درجه سلسيوس در 2/4±1 ( مطابق بند 5-2-1) تنظيم و تا خط نشانه آن را رقيق كنيد و به مدت 15 دقيقه تكان دهيد . محلول بدست آمده را به مدت يك شب ساكن بگذاريد .

 از اين محلول اوليه , محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد را كه دربندهاي 5-3-2 و 5-3-3 مشخص گرديده است را تهيه و جذب نوري آنها را نسبت به آب مقطر مطابق بند 5-2-1 تعيين كنيد . اين محلول اوليه را با مقدار حساب شده‏اي از محلول بافر سيترات ( بند 5-2-4) رقيق كنيد تا محلول استانداردي بدست آيد كه محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد آن داراي جذب نوري يكسان با محلول‏هاي مقايسه‏اي استاندارد بدست آمده از محلول استاندارد اوليه ( بند 5-2-1) باشد . به اين محلول مطابق بند 5-2-1) نگهدارنده بيافزائيد و به مدت يك شب ساكن بگذاريد . ( يادآوري بند 5-2-.2)

 5-2-4- محلول بافر :

 اين محلول براي رقيق كردن بكار مي‏رود و به طريق زير تهيه مي‏گردد . مقادير مواد زير را در يك بالن حجمي يك ليتري كه حاوي 600 ميلي ليتر آب مقطر است , بريزيد .

 - 2/08 گرم دي سديم هيدروژن ارتوفسفات با دو مولكول آب تبلور

 - 15/8 گرم اسيد سيتريك با يك مولكول آب تبلور

 سپس آنها را توسط به هم زدن حل كنيد و با آب مقطر به خط نشانه برسانيد و هرگونه رقيق كردن مورد نياز بايد توسط اين محلول بافر انجام شود . امكان دارد مقادير چند برابر شده از اين مواد شيميائي و آب مقطر بر طبق نياز تهيه گردد .

 5-3- محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد آميدوبلاك :

 محلولهاي رقيق شده‏اي ( محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد ) از محلول استاندارد آميدوبلاك ( بند 5-2) بصورت زير تهيه كنيد .

 5-3-1- ده حجم از محلول استاندارد آميدوبلاك را با نود حجم از آب مقطر رقيق كنيد . بدين صورت كه 10 ميلي ليتر از محلول استاندارد آميدوبلاك را در يك بالن حجمي 100 ميلي ليتري بريزيد و آن را تا خط نشانه با آب مقطر رقيق كنيد .

 يادآوري : اين محلول بجاي آب مقطر براي تنظيم صفر اسپكتروفتومتر ( بند 6-6) بكار ميرود .

 5-3-2- 50 حجم از محلول استاندارد آميدوبلاك را با 50 حجم آب مقطر رقيق كنيد , بدين صورت كه 50 ميلي ليتر از محلول استاندارد آميدوبلاك را در يك بالن حجمي 100 ميلي ليتري بريزيد و آن را تا خط نشانه با آب مقطر رقيق كنيد .

 5-3-3- 20 حجم از محلول استاندارد آميدوبلاك را با 80 حجم آب مقطر رقيق كنيد . بدين صورت كه 20 ميلي ليتر از محلول استاندارد آميدوبلاك را در يك بالن حجمي 100 ميلي ليتري بريزيد و آن را تا خط نشانه با آب مقطر رقيق كنيد .

 يادآوري : محلولهاي بندهاي 5-3-2 و 5-3-3 معادل مقادير كم و زياد پروتئين مي‏باشند و ارزشهاي مربوطه دستگاهي را مشخص مي‏سازند . از اين محلولها براي كنترل كاليبراسيون 16 ( بند 8-6) استفاده ميشود .

 5-4- محلولهاي استاندارد بافر ( بافر 2 و 7) براي كاليبراسيون pH متر ( بند 6-.8)

  6 ـ وسايل مورد نياز

 كليه وسايل كه با مواد شيميائي يا محلولهاي آزمايش در تماس هستند , بايد از موادي ساخته شده باشند كه تحت تاثير شرايط آزمايش قرار نگيرند و به مقدار كافي ماده رنگي را جذب نكنند تا باعث تأثير در نتايج آزمايش نگردند . علاوه بر تجيهزات متعارف آزمايشگاه , وسايل ويژه زير مورد نياز مي‏باشند :

 6-1- لوله‏هاي آزمايش يا سانتريفوژ كه در صورت لزوم بخوبي و بطور محكم توسط درپوش لاستيكي بسته شوند .

 6-2- جا لوله‏اي ويژه لوله‏هاي آزمايش و يا لوله‏هاي سانتريفوژ

 6-3- پي پت يا سرنگ براي انتقال 1/00±0/003 ميلي ليتر شير ( يادآوري بند 6-4)

 6-4- پي پت يا سرنگ براي انتقال 20±0/02 ميلي ليتر محلول استاندارد آميدوبلاك ( بند 5-2)

 يادآوري 1: پي پت يا سرنگهاي ( بندهاي 6-3 و 6-4) با ظرفيتهاي ديگر نيز ممكن است استفاده شوند , بشرطي كه نسبت به حجم آزمونه ( بند 8-2) به محلول آميدوبلاك ( بند 8-3-1) 1 به 20 و غلظت آميدوبلاك در مايع بالاي رسوب ( بند 8-3-3) هميشه بيش از 0/1 گرم در ليتر باشد .

 يادآوري 2: هر نوع وسيله پي پت كردن چندتايي مورد استفاده بايد شرايط مذكور در روش شرح داده شده در مورد تك پي پت و تك سرنگ در اين استاندارد را داشته باشد .

 6-5- تكان دهنده مكانيكي 17 يا مخلوط كن چرخان 18 يا در صورت نياز وسيله مخلوط كننده با هواي فشرده .

 6-6- اسپكتروفتومتر مناسب براي عمل در محدوده طول موج 550 تا 620 نانومتر مشروط بر اينكه طول مسير نوري سلهاي 19 ( ترجيحا داراي رابط جريان 20 آن 10 ميلي‏متر باشد .

 يادآوري : استفاده از طول موج دقيق مطابق با حداكثر حساسيت آنچنانكه در آزمايش آمده است , ضروري نمي‏باشد و عملا كاليبراسيون 21 كليه انحرافات را جبران مي‏كند (. بند 8-4)

 6-7- سانتريفوژ يا وسيله صاف كردن

 يادآوري : سانتريفوژهاي متناسب با جا لوله‏اي و دستگاه پي پت كردن چندتايي براي اندازه‏گيري دسته نمونه‏ها مورد نياز مي‏باشند ( بندهاي 6-6 و 6-.7)

 6-7-1- سانتريفوژ داراي جا لوله‏اي‏هاي نوسان كننده كه بتواند حداقل در مدت دو دقيقه ايجاد g(350±50) شتاب در انتهاي پائيني لوله آزمايش ( بند 10-1) بكند . اين شتاب توسط سانتريفوژهايي ايجاد مي‏شود كه داراي شعاع موثر ( فاصله افقي بين مركز محور سانتريفوژ و انتهاي پاييني لوله آزمايش ) و بسامدهاي چرخشي تعيين شده در جدول زير باشند .

 يادآوري : شتاب نسبي سانتريفوژي كه در يك سانتريفوژ ايجاد ميشود , از فرمول زير بدست مي‏آيد :

 كه در آن :

 r = شعاع افقي موثر

 و

 n = بسامدهاي چرخشي در دقيقه

 6-7-2- وسيله صاف كردن

 عمل كردن با اندكي فشار با استفاده از صافي با الياف شيشه‏اي ( ترجيحا سيليكوني شده ) را مي‏توان بجاي عمل سانتريفوژ كردن بكار برد . كنترل مقدار رنگ جذب شده توسط صافي ضروري است . مقدار جذبي بايد حداقل و براي واحد سطح ثابت باشد . منافذ صافي بايد تحت تاثير فشار وارده , اجازه صاف كردن صحيح رسوب حاصل از تركيب رنگ - پروتئين را بدهد . ( بند 10-1)

 6-8- pH متر با الكترود شيشه‏اي و الكترود مرجع مناسب كه قادر به اندازه‏گيري pH با تقريب 0/01 واحد pH باشد .

 6-9- بالنهاي حجمي 22 با يك خط نشانه در حجمهاي 100, 1000, 2000

 6-10- ترازو با دقت حداقل 0/001 گرم

 6-11- بشر با حجم مناسب

 7 ـ نمونه‏برداري

 طبق استاندارد شماره 326 ( روش نمونه‏برداري شير و فرآورده‏هاي آن ) انجام مي‏گيرد .

 8 ـ روش آزمون

 8-1- آماده سازي آزمايه 23:

 در صورت لزوم , دماي نمونه را با قرار دادن بطري شير در حمام بخار به 20 تا 30 درجه سلسيوس برسانيد . شير را كاملا با سه يا چهار مرتبه واژگون كردن بطري به آرامي مخلوط كنيد , بطوريكه كف نكند و چربي مجتمع نشود . در صورتي كه پيدايش اندكي چربي ايجاد اشكال كرد شير را به آرامي تا 35 تا 40 درجه سلسيوس در حمام آب گرم و سپس آن را به آرامي مخلوط كنيد . همچنين در صورت لزوم مي‏توان از دستگاه همگن ساز 24 مناسب براي پخش چربي استفاده كرد .

 هنگامي كه توزيع يكنواخت چربي انجام گرفت , بسرعت دماي آن را به 20 درجه سلسيوس برسانيد . شير را به مدت حداقل يك دقيقه بعد از تنظيم دماي نهايي ساكن بگذاريد تا حبابهاي هوا خارج شوند ( اين مدت زمان نبايد آنقدر طولاني باشد كه موجب تجمع چربي شود .)

 8-2- آزمونه 25 :

 ابتدا نمونه آماده ( بند 8-1) را كمي مخلوط كنيد تا از يكنواختي آن مطمئن شويد و سپس يك ميلي ليتر از آن توسط پي پت يا سرنگ ( بند 6-4) درون لوله آزمايش يا سانتريفوژ ( بند 6-1) بريزيد .

 8-3- اندازه‏گيري :

 8-3-1- 20 ميلي ليتر از محلول استاندارد آميدوبلاك ( بند 5-2) را بوسيله پي پت يا سرنگ ( بند 6-4) بر روي آزمونه بريزيد . در صورت لزوم درپوش لوله را محكم بگذاريد و محتويات لوله را به مدت 30 ثانيه با تكان دادن مكرر در مسير حدود 25 سانتيمتر و يا توسط مكانيكي ( بند 6-5) مخلوط كنيد . براي تامين آميختن مؤثر متناوبا از هواي فشرده استفاده كنيد .

 8-3-2- درپوش لوله را برداريد و رسوب پروتئين - رنگ را توسط صاف كردن يا سانتريفوژ كردن جدا كنيد . براي سانتريفوژ كردن , لوله را در سانتريفوژ ( بند 6-7-1) قرار دهيد و پس از آنكه شتاب در انتهاي لوله سانتريفوژ به g(350±50) رسيد , حداقل به مدت دو دقيقه سانتريفوژ كنيد .

 8-3-3- سل را از مايع صاف شده پر كنيد و پس از تنظيم صفر اسپكتروفتومتر ( بند 6-6,) جذب نوري آن را در مقابل محلول مقايسه‏اي استاندارد آميدوبلاك ( بند 5-3-1) در طول موج انتخابي ( بند 6-6) تعيين كنيد .

 8-4- تهيه منحني كاليبراسيون 26:

 حداقل حدود 40 نمونه از شيرهاي مختلف ( در صورت امكان شيرهاي بدست آمده از 40 دام مختلف ) كه داراي مقدار پروتئين تام 2/5 تا 4/5 درصد ( جرم / جرم ) و يا بيشتر از اين مقدار هستند ( به يادآوري مراجعه شود ) را تهيه كنيد . مقدار پروتئين هر كدام را طبق روش مرجع كجلدال تعيين و در صورت لزوم نتايج را در موارد افزودن نگهدارنده ( بند 10-1) تصحيح كنيد .

 با استفاده از روش مشروح , جذب نوري مايع صاف شده فوقاني بدست امده از هر نمونه را اندازه بگيريد .

 مقدار پروتئين بدست آمده بوسيله روش مرجع در مقابل جذب نوري را تعيين و در روي منحني نقطه‏گذاري كنيد هرگونه انحراف از همبستگي خطي در انتهاب منحني داراي پروتئين زياد ( جذب نوري كم ,) صحت نتايج مرتبط را در محاسبه معادله برگشت خطي 27 از بين مي‏برد . ( روش اندازه‏گيري اين مقدار پروتئين زياد در بند 10-2 شرح داده شده است .) مقاديري كه داراي انحراف بسيار زياد مي‏باشند نيز در محاسبه معادله برگشت خطي27 منظورنمي‏گردند . مانند مقدار پروتئيني كه بوسيله روش مرجع اندازه‏گيري شده و بيش از دو برابر انحراف معيار ( از محاسبه معادله خطي زير نتيجه مي‏گردد ) از مقدار مربوطه در منحني تفاوت دارد .

 معادله برگشت خطي براي مقدار پروتئين اندازه‏گيري شده , توسط روش مرجع (Y) را در مقابل جذب نوري (X) بدست آوريد و منحني كاليبراسيون 28 را براي Y و X رسم كنيد . اين توزيع داراي معادله bx+a=Y مي‏باشد .

 يادآوري 1: منحني كاليبراسيون بايد از ميانگين مقادير X و Y عبور كند و مجموع انحرافات نسبت به خط صفر باشد و يا اينكه مجموع مربع انحرافات حداقل گردد ( مجموع مربع انحرافات براي هر خط ديگر قابل رسم بزرگتر است .) فرمولهاي مورد نياز براي محاسبه معادله برگشت خطي بصورت زير مي‏باشد :

 يادآوري 2: شيرهاي حرارت ديده ( پاستوريزه يا سترون ) و شيرهاي باز ساخته احتياج به منحني كاليبراسيون جداگانه‏اي دارند .

 8-5- محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد

 همزمان با تهيه منحني كاليبراسيون جذب نوري دو محلول مقايسه‏اي استاندارد را كه در بندهاي 5-3-2 و 5-3-3 آماده شده‏اند را اندازه‏گيري كنيد ( يادآوري بند 5-2-2)

 8-6- كنترل كاليبراسيون

 عمل كنترل نهايي و تنظيم غلظت با استفاده از نمونه شاهد شير كه از نمونه حجم شير بدست آمده و مقدار پروتئين آن توسط روش مرجع كجلدال مشخص گرديده انجام ميشود .

 8-6-1- نمونه‍هاي شاهد شير

 از آنجا كه ممكن است تحت تاثير تغييرات فصلي و بخشهاي مختلف نيتروژني شير قرار گيرد , بنابراين غالبا بطور متناوب كنترل شود . اين عمل با استفاده از حداقل يك نمونه شاخص 29  با حجم زياد ( حاصله از تعداد زيادي دام ) كه داراي مقدار پروتئين متوسط مي‏باشد و يا ترجيحا با استفاده از دو نمونه با پروتئين زياد و كم كه بوسيله روش مرجع كجلدال اندازه‏گيري شده‏اند , انجام مي‏گيرد .

 8-6-2- كاربرد نمونه‏هاي شاهد شير

 ضرورت دارد كه گاهي نمونه‏هاي شاهد براي تصحيح كشش يا رانش 30 جذب نوري مورد كنترل قرار گيرند .

 از آنجا كه روش كاليبراسيون طولاني است , لذا آزمايشگاههايي كه تعداد محدودي اندازه‏گيري بر روي نمونه‏هاي خاصي را عهده‏دار مي‏باشند , غالبا از محلولهاي رنگي يا شاهدهاي آزمايشگاههاي مركزي استفاده مي‏كنند .

 مقدار كافي نمونه‏هاي شير را توسط نمونه‏برداري فرعي از نمونه شاخص ( مطابق بند 8-6-1) تهيه كنيد و يك نگهدارنده ( بند 10-1) بايد به اين نمونه‏هاي فرعي افزوده گردد , بنابراين اين نمونه‏ها مي‏توانند به مدت طولاني مورد استفاده قرار گيرند , بشرط آنكه مقدار مرجع پروتئين آنها در طي تخريب , تغيير نكند .

 نمونه يا نمونه‏هاي شاهد شير بايد بصورت دوتايي قبل از هر بار آزمايش روزمره نمونه‏ها , مورد آزمايش قرار گيرند . بطور معمول بايد به هر دسته نه تايي نمونه‏هاي روزمره , يك نمونه شاهد افزوده شود و يا اينكه نمونه‏هاي شاهد را در فواصل معين آزمايش نمونه‏ها قرار گيرند تا بدينوسيله كشش يا رانش مورد كنترل قرار گيرد . همچنين ضروري است كه متشابه با اين عمل , براي كنترل قرائت‏هاي اسپكتروفتومتر از محلولهاي مقايسه‏اي استاندارد , استفاده شود زيرا كه قرائت جذب نوري نمونه‏ها , همزمان با كاليبراسيون انجام مي‏گيرد ( بندهاي 8-5 و 8-6-.1)

  9 ـ بيان نتايج

 9-1- روش محاسبه :

 بوسيله منحني كاليبراسيون ( بند 8-4) مقدار پروتئين نمونه را با جذب نوري اندازه‏گيري شده بدست آوريد و نتيجه را بر حسب گرم پروتئين در هر 100 گرم نمونه بيان كنيد . هرگونه تفاوت ميان مقدار پروتئين نمونه يا نمونه‏هاي شاهد شير كه با روش كجلدال و منحني كاليبراسيون بدست آمده را تصحيح كنيد ( بندهاي 8-6-1 و 8-6-2)

 9-2- تكرارپذيري انفرادي :

 تفاوت ميان نتايج دو اندازه‏گيري , در آزمايشات پياپي سريع كه بوسيله يك آزمايش كننده انجام گرفته است , نبايد بيش از 0/03 گرم در هر 100 گرم نمونه گردد .

 10 ـ موارد خاص

 10-1- نمونه‏هاي حاوي نگهدارند :

 اين روش بدون هيچگونه تغييري براي نمونه‏هايي كه داراي نگهدارنده از 0/07 تا 0/1 درصد ( جرم / جرم ) كلرور جيوه دو ظرفيتي ( در صورتي كه طبق مقررات براي جلوگيري از فساد مجاز باشد ) و يا 0/02 تا 0/3 درصد ( جرم / جرم ) سديم آزايد 31 و نيز براي نمونه‏هايي كه داراي نگهدارنده 0/1 درصد ( جرم / جرم ) دي كرومات پتاسيم مي‏باشند قابل اجرا است , مشروط بر اينكه بين زمان افزودن محلول آميدوبلاك به شير و قرائت اسپكتروفتومتر مانند روش صاف كردن ( بند 6-7) خيلي كوتاه باشد ولي در مواردي كه روش سانتريفوژ كردن بكار مي‏رود و همچنين براي نمونه‏هايي كه حاوي نگهدارنده فرم آلدئيد مي‏باشند , اين روش قابل اجرا نمي‏باشد .

 در مواردي كه از قرصهاي نگهدارنده استفاده ميشود , اين قرصها معمولا حاوي 0/5 درصد ( جرم / جرم ) كلرور سديم مي‏باشند كه موجب تاثيراتي بر ميزان جذب نوري و همچنين نتايج اندازه‏گيري پروتئين به روش كجلدال مي‏گردند . بنابراين بهتر است مقدار پروتئين نمونه را توسط منحني كاليبراسيون ويژه‏اي بدست آورد كه اين منحني برحسب نمونه‏هاي محافظت شده و بر مبناي نتايج تصحيح شده حاصل از مواد نگهدارنده تهيه شده باشد . زيرا در محلول , مواد محافظي چون نيتروژن ( منشعب از سديم آزايد و غيره ) وارد ميشود كه در مقدار ازت و منحني كاليبراسيون تاثير آشكاري دارد .

 10-2- انحراف از خط مستقيم در منحني كاليبراسيون :

 براي شيرهايي كه مقدار پروتئين بالايي دارند و نتايج حاصل از آنها در منحني كاليبراسيون قرار نمي‏گيرند , بطريق زير عمل كنيد .

 مقدار معيني از نمونه شير را كه داراي پروتئين بالايي مي‏باشد , با هم حجم آن نمونه شير ( استاندارد , شاهد ) كه مقدار پروتئين آن معلوم مي‏باشد , بخوبي مخلوط و مقدار پروتئين اين مخلوط را طبق بندهاي 8-3 و 9-1 اندازه‏گيري كنيد .

 مقدار پروتئين نمونه شيري كه پروتئين بالا دارد (W1) از روي مقدار پروتئين مخلوط (W2) و مقدار پروتئين شاهد يا استاندارد (W3) توسط معادله زير بدست آوريد :

 11 ـ گزارش آزمون

 در گزارش آزمون بايد روش مورد استفاده و نتيجه بدست آمده ارائه گردد . اين گزارش همچنين بايد شامل مطالب زير باشد :

 الف ) ضريب مورد استفاده براي بدست آوردن مقدار پروتئين توسط اندازه‏گيري نيتروژن موجود با استفاده از روش مرجع .

 ب ) هر موردي كه دلالت بر غير صيح بودن نتايج بكند و يا از دقت عمل بكاهد .

 ج ) كليه جزئيات مورد نياز براي شناخت كامل نمونه .

 

 

 

1-Amido black dye - binding method

2-Whole milk

3-Sterilized milk

4-Homogenized milk

5-Reconstituted

6-True protein

7-Kjeldhal

8- Non - protein Nitrogen (NPN

9-Test portion

10- Calibration Curve

11- Amido black 10 B Dye Stuff

12-Mechanical agitator

13-Volumetric Flask

14-Standard matching Solutions

15-Cell

16-Calibration Control

17-Mechanical shaker

18-Rotary mixer

19- Cells

20- Flow through

21- Calibration

22- Volumetric Flask

23- نمونه‏اي كه از نمونه آزمايشگاهي تهيه و براي انجام آزمونها آماده ميشود .

Test sample

24-Homogenizer

25- مقدار معيني از آزمايه كه براي يك آزمون بكار ميرود .

Test Portion

26-Calibration Curve

27-Regression Equation

28-Calibration curve

29-Representative sample

30- مدت زماني كه اسپكتروفتومتر , جذب نوري يا درصد عبور نور را ثابت نشان مي‏دهد . Drift

31-Sodium azide


 

ISLAMIC REPUBLIC OF IRAN

 

Institute of Standards and Industrial Research of Iran

 

ISIRI NUMBER

 

3768

 

 

MILK - DETERMINATION OF PROTEIN CONTENT-

AMIDO BLACK DYE-BINDING METHOD

 

 

First Revision

First Edition